In alten Urkunden finden sich die Bezeichnungen Olthena oder Altena. Möglicherweise bezeichnet die Wortendung -a das spätere Wort au, denn nicht zuletzt zeigt der Name Levensau, dass aus dem Nordischen stammende Bezeichnungen durchaus in Gebrauch waren. Der Zusammenhang mit dem heutigen Holtenau ist ungeklärt.
Seit dem 15. Jahrhundert finden sich sichere Informationen über das Bauerndorf Holtenau. Das Dorf gehörte erst zum Gut Knoop, dann zum Gut Seekamp, das dort im 17. Jahrhundert am Ort der heutigen Dankeskirche einen Meierhof errichtete. Da die Siedlung nördlich der Levensau lag, gehörte sie zu Schleswig. Der Großteil der Stadt Kiel gehört zu Holstein.
Der Bau des Alten Eider-Kanals im Süden des Dorfes und dessen Fertigstellung 1779 hatte nur geringen Einfluss auf den Ort.
1791 wurde im Gutsbezirk Seekamp und damit auch in Holtenau die Leibeigenschaft aufgehoben. Ab 1867 gehörte Holtenau zum Kreis Eckernförde und zählte um die 400 Einwohner.
Der 1895 fertiggestellte Kaiser-Wilhelm-Kanal (später Nord-Ostsee-Kanal) veränderte nicht nur das Gesicht Holtenaus fundamental, sondern führte durch die Schaffung von neuen Behörden für den Kanalbetrieb, den Zuzug von Händlern und Fachpersonal, der Schaffung notwendiger Infrastruktur (z. B. Brücke und Fähre über den Kanal) zu einer neuen Bebauung, die den dörflichen Charakter zurückdrängte. Zu dieser Zeit hatte Holtenau knapp 1100 Einwohner.
Wie an der gesamten Kieler Förde wurden auch in Holtenau Befestigungsanlagen errichtet (Fort Holtenau), die jedoch nie zum Einsatz kamen und nach dem Ersten Weltkrieg geschleift wurden. 1913 wurde Holtenau zur Keimzelle des kaiserlichen Seefliegerwesens, aus dem später die Marinefliegerei hervorging.
Das Ende des Ersten Weltkriegs und der Monarchie brachten auch den vorläufigen Abzug der Marine und der Seeflieger. Als Holtenau 1922 nach Kiel eingemeindet wurde, zählte man über 3000 Einwohner.
Im Jahr 1997 wurden Teile des Holtenauer Stadtteilgebiets nach Altenholz umgemeindet. Im Gegenzug wurden Teile des Altenholzer Gemeindegebiets Kiel-Pries zugeschlagen.
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